Aunque la luz visible se sustituye por haces de electrones de longitud de onda más corta y alta energía para lograr una resolución a nivel nanométrico, en un principio se consideró que el microscopio electrónico sólo era aplicable a materiales inorgánicos y no a tejidos biológicos. La razón principal era que la muestra se destruiría por el vacío, la deshidratación y el bombardeo de electrones de alta energía; es difícil dejar sombras en la película porque los tejidos biológicos son casi transparentes a los electrones. Además de la tinción negativa con metales pesados, otra solución es el criomicroscopio electrónico o crio-EM. Las proteínas o los tejidos congelados rápidamente se visualizan en proyecciones 2D mediante un microscopio electrónico de transmisión y, a continuación, sus estructuras 3D se reconstruyen por algoritmo y ordenador a partir de estas proyecciones 2D.
Historia de la crio-EM: espécimen vitrificado a alta presión
Ya en 1934, Marton propuso congelar las muestras para superar diversos inconvenientes de la TEM. Sin embargo, los científicos descubrieron que esta vía parecía inviable: una vez que el agua se congela, se organiza en cristales regulares que cortan y comprimen las muestras biológicas. Lo que se ve en la TEM es una muestra gravemente dañada. La congelación también trajo consigo problemas más graves: los haces de electrones que atravesaban los cristales de hielo se difractaban fuertemente, dejando en la pantalla patrones de difracción ininteligibles. La ventaja de la imagen directa desaparecía por completo. Más tarde, los científicos descubrieron que si el agua líquida se colocaba a temperaturas extremadamente bajas, se transformaba directamente en hielo vítreo cuyas moléculas se disponían en patrones desordenados. El hielo vítreo es más bien un líquido extremadamente viscoso sin estructura cristalina. Por lo tanto, se evitan las muestras dañadas y la difracción.
El primer criomicroscopio electrónico práctico fue fabricado por el profesor Dubochet y su equipo del Laboratorio Europeo de Biología Molecular. Inicialmente, se esperaba que el nitrógeno líquido congelara rápidamente las muestras biológicas, pero era tan frío que se producía el efecto Leidenfrost. La muestra estaba envuelta por una capa de aire para bloquear la disipación del calor, y seguían existiendo cristales de hielo. Más tarde, los científicos optaron por el etano líquido, con un punto de ebullición más alto, que entraba en contacto directo con las muestras y las congelaba al instante. La congelación a alta presión también fue inventada por el equipo de Dubochet para aumentar la profundidad de vitrificación. Las muestras biológicas vitrificadas se convirtieron en láminas ultrafinas en las que se conservaron las ultraestructuras en estado vivo.
Fue sorprendente que el estado vítreo casi resolviera todos los inconvenientes de la TEM tradicional. El criomicroscopio electrónico reduce entre 4 y 5 veces el daño por radiación y mejora la resolución y el contraste. Al mismo tiempo, el criomicroscopio electrónico tiene una ventaja incomparable: no requiere la preparación de cristales. No todas las sustancias pueden cristalizarse, especialmente las proteínas incrustadas en membranas biológicas, pero casi todas pueden congelarse, ya sean proteínas, virus u orgánulos.
Reconstrucción 3D y DDD en crio-EM
Una proyección 2D contiene muchas proteínas dispuestas al azar y un poco de impurezas, por lo que Frank y Marin van Heel desarrollaron un algoritmo para extraer las características y orientaciones de cada molécula ocultas en la proyección. A partir de esta información, se eliminaron las impurezas y se clasificaron las proteínas. Las proyecciones de proteínas del mismo grupo eran lo suficientemente similares como para superponerlas y promediarlas para mejorar la relación señal-ruido. Frank también inventó la inclinación cónica aleatoria para convertir las proyecciones 2D en imágenes 3D. Aunque los científicos han desarrollado otros algoritmos para identificar proteínas y mejorar la relación señal-ruido, la resolución de la crio-EM era sólo de unos 10 Å hacia 2010.
El dispositivo de detección directa de electrones (DDD) provocó una revolución en la resolución de los microscopios electrónicos hacia 2010. El DDD captura directamente los electrones para convertirlos en imágenes digitales (electrones → corriente → imagen). En comparación con el dispositivo de acoplamiento de carga tradicional, esta nueva cámara descarta la conversión de electrones en señales luminosas, por lo que se minimiza el ruido introducido durante la conversión de la señal. Al igual que la grabación de una película, el DDD puede capturar rápidamente señales para revelar la estructura dinámica de las proteínas durante las reacciones bioquímicas, y corregir la deriva causada por la irradiación de electrones y el movimiento térmico. La resolución actual de la crio-EM ha alcanzado casi 1 Å, suficiente para rivalizar con la difracción de rayos X.