Microscopio Electrónico de Transmisión: Historia, Romper límite de difracción de Abbe, Tinción Negativa

Resolución del microscopio óptico: límite de difracción de Abbe

La distancia más pequeña distinguible por el ojo desnudo es generalmente de unos 0,1 mm. Los microscopios se utilizan para identificar sustancias más pequeñas, como bacterias, hongos, protistas y algunas estructuras subcelulares. Los científicos esperan explorar objetos aún más pequeños, especialmente virus. Sin embargo la fórmula de Abbe echó por tierra todas las esperanzas.

En 1872, la revolucionaria difracción de Abbe para microscopio fue calculada por el físico alemán Ernst Karl Abbe. Se dice que la resolución de todos los microscopios ópticos tiene un límite físico debido a la difracción, que es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto objetivo. Esto significa que los microscopios ópticos sólo pueden identificar objetos tan pequeños como 200 nm, ya que la luz violeta tiene la longitud de onda más corta con unos 400 nm entre la luz visible. A finales del siglo XIX, los microscopios ópticos más finos ya se acercaban a este límite, pero seguían sin poder hacer nada sobre la ultraestructura de los orgánulos, por no hablar de las moléculas y los átomos.

El límite de difracción de Abbe era tan formidable que incluso Abbe, la persona que lo propuso, tuvo que suspirar que todos los esfuerzos fueron en vano y nadie pudo traspasar esta limitación física. Sin embargo, lo que Abbe no previó fue que apenas 20 años después de su muerte la onda de de Broglie u onda de materia impulsaría el nacimiento de una herramienta aún más poderosa herramienta: el microscopio electrónico.

TEM frente al microscopio óptico: La ruptura de Abbe límite de difracción

De Broglie estudió historia y literatura antes, por lo que su mentalidad no se rige por los conceptos tradicionales. Puesto que Einstein creía que la luz es a la vez onda y partícula, los electrones también deberían mostrar la dualidad onda-partícula dualidad onda-partícula. En 1923, Louis de Broglie dedujo la fórmula de la longitud de onda del electrón: p = h/λ. En 1927, se demostró que los electrones eran una onda porque los investigadores observaron una interferencia en el experimento de la doble rendija. En 1931, el ingeniero alemán Max Knoll y Ernst Ruska construyeron el primer microscopio electrónico de transmisión (MET) del mundo con un aumento de unos 200. La luz visible fue sustituida por haces de electrones y las lentes de cristal se sustituyeron por lentes magnéticas, pero se trataba simplemente de una máquina rudimentaria para comprobar si un microscopio electrónico era factible. Dos años más tarde, un TEM mejorado podía ampliar los objetos hasta 12.000 veces. Su resolución de 50 nm de resolución ya había superado a todos los microscopios ópticos tradicionales.

La primera fotografía de un espécimen biológico fue tomada por Ladislaus Marton en 1934. Era una rebanada de 15 micras de grosor de una drosera hoja de planta. El primer virus captado por un microscopio electrónico fue el virus del mosaico del tabaco del tabaco en 1939. El virus ilusorio se transformó en una entidad que podía ser observar directamente. Los científicos descubrieron nuevos orgánulos, como el endoplasma retículo, el ribosoma y el lisosoma. Las imágenes TEM del aparato de Golgi pusieron fin a un debate de medio siglo sobre su existencia. La ultraestructura detallada de orgánulos también fue revelada por la TEM, como las crestas en las mitocondrias y los tilacoides en los cloroplastos.

Desarrollo de la TEM: Muestra Dañada, tinción negativa y reconstrucción 3D

Sin embargo, cuando el microscopio electrónico de transmisión microscopio electrónico de transmisión, muchos biólogos y físicos eran conservadores o escépticos sobre su aplicación en biología. Los tejidos están principalmente compuestos de elementos más ligeros como carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno (C, H, O, N) que interactúan débilmente con los electrones, y los haces de electrones los penetran sin esfuerzo. Por lo tanto, todas las cosas tienen un brillo similar en las imágenes. El contraste puede mejorarse con una dosis alta, pero el bombardeo de electrones romperá los enlaces químicos en las macromoléculas biológicas. El vacío y la deshidratación evitan la imagen borrosa resultantes de la dispersión de electrones debida al aire, pero cambiarán la muestra estructura, y lo que ven los investigadores puede distar mucho del tejido vivo.

Aun así, algunos científicos siguen insistiendo en mejorar la tecnología TEM, y la tinción negativa de metales pesados es una técnica clave. Los metales pesados son absorbidos por la muestra y se acumulan en la superficie, huecos y depresiones. Las áreas elevadas tienen menos tinción. Es difícil para el haz de electrones penetrar los metales pesados con alta densidad de electrones, y estas zonas presentan sombras más oscuras para revelar el contorno y los detalles de la muestra. Algunos daños causados por el bombardeo de electrones y el vacío también se ven debilitados por los metales pesados metales pesados que actúan como un escudo protector alrededor de la muestra. En la década de 1950, las técnicas para obtener muestras ultrafinas habían madurado, y algunas estructuras biológicas complejas fueron desveladas mediante TEM, como los cromosomas y las mitocondrias. Fue una época apasionante, ya que una sola imagen TEM era a menudo el prototipo de un importante trabajo biológico. La congelación es otro método para reducir los daños, lo que dio lugar a la aparición de la crio-EM.

Pronto se hizo evidente que cada imagen de microscopio electrónico es una proyección 2D. Si se quiere reconstruir la estructura 3D estructura a partir de proyecciones 2D, se necesitan muchas imágenes desde diferentes ángulos. Por conveniencia, los científicos eligieron la cola del fago T4 con su bella simetría rotacional y la resolvieron con éxito en 1968. Para muestras asimétricas, se utiliza la teoría de la línea común para relacionar su proyección 2D con la 3D estructura.