Aunque Frederick Griffith descubrió que las bacterias R podían transformarse en bacterias S dentro de los ratones, él no profundizó en qué sustancia facilitaba este cambio. La mayoría de los científicos creían que la sustancia era proteína. Sin embargo, algunos científicos eran escépticos al informe de Griffith, por lo que se embarcaron en el camino de explorar material genético (ADN), entre quienes Oswald Avery era una figura notable. Fue una década de investigación por él y su equipo para probar que sustancia transformadora era ADN.
Antecedentes: conclusión de experimento de Griffith fue confirmada por otros científicos.
Oswald Avery era un investigador en la institución Rockefeller dedicado a aislamiento, clasificación de neumococos. Él también identificó bacterias R y bacterias S. La química de cápsula de polisacáridos fue cuidadosamente explorada por él, así como relación a virulencia e inmunidad. Sin embargo, transformación de bacterias no fue observada por él. Por lo tanto, él era escéptico acerca de experimento de Griffith en primera vez.
Poco después de que Frederick Griffith publicó su artículo, Fred Neufeld de Alemania y colegas en la institución Rockefeller replicaron su experimento. Bacterias podían mutar en ratones durante experimento de Griffith, pero no se sabía si podían mutar en plato de cultivo. En consecuencia, experimento fue mejorado por colegas de Avery para explorar transformación fenómeno más profundamente. En 1929, en Michael Dawson' artículo, bacterias R fue descrita para transformarse en bacterias S en una placa de Petri. James Alloway trató de expandir en hallazgos de sus colegas en 1930. Él trituró bacterias S para liberar sus sustancias internas. Luego, desechos celulares fueron filtrados para obtener extracto libre de células, que podía todavía transformar bacterias R en bacterias S in vitro. Así, James Alloway creyó que sustancia relacionada a rasgo hereditario ni de ratones ni cáscara de polisacárido, sino de una sustancia activa dentro de bacterias.
Cómo Oswald Avery cultivó bacterias y extrajo ácidos nucleicos
A veces, bacterias R transforman en tipo S espontáneamente incluso en ausencia de factores externos. Obtener una cepa R estable era crucial. Colin MacLeod se unió al equipo de Avery en 1934 hasta que tomó posición en Universidad de Nueva York en 1940. MacLeod identificó una cepa R estable de una cepa II S, que fue ampliamente utilizada en transformación fenómeno. Él también hizo progreso en adquirir extractos fiables y determinar su actividad. En 1941, McCarty se unió al equipo de Avery para reemplazar MacLeod. MacLeod todavía vino al laboratorio frecuentemente.
Bacterias son inactivadas a 65°C. Son lavadas con solución salina para remover pared celular y citoplasma. Ácidos nucleicos son disueltos por desoxicolato de sodio y alcohol. Los investigadores usaron cloroformo y enzimas para remover proteínas, polisacáridos, lípidos y ARN de ácidos nucleicos para obtener un principio transformador puro.
Oswald Avery y su equipo analizaron composición química y propiedades de principio transformador. La excelente estabilidad térmica retiene su actividad incluso expuesta a 65°C por 30 a 60 minutos. Era soluble en soluciones salinas alcalinas pero precipitaría en solventes orgánicos. Las proporciones de carbono, hidrógeno, nitrógeno y fósforo estaban cerca de valores teóricos de ADN. Principio transformador no reaccionó con reactivos para detectar proteínas y ARN, pero se volvió azul cuando se trató con detectores de ADN en un baño de agua hirviendo.
Experimento de Oswald Avery: principio transformador era ADN.
Bacterias R fueron cultivadas por 36 generaciones para lograr estable herencia genética. Esta vez, casi nunca transformaron de nuevo a bacterias S espontáneamente. Sin embargo, estas bacterias todavía se convirtieron en bacterias S cuando expuestas a principio transformador tratado por tripsina, quimotripsina (que hidroliza proteínas), y RNasa. Cuando Avery mezcló principio transformador con DNasa, no se encontraron bacterias de tipo S en platos de cultivo. Por lo tanto, no era ni proteína ni ARN. Lípidos y polisacáridos fueron también excluidos de candidatos, ya que lípidos serían disueltos por alcohol y cloroformo, y cápsula de polisacáridos fue hidrolizada por enzimas durante extracción. Oswald Avery y su equipo estaban convencidos principio transformador era ADN que jugaba fundamental papel en herencia.